1. Gerçek zamanlı kantitatif PCR
1996 yılında, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (gerçek zamanlı qPCR) ilk olarak amerika birleşik devletleri'nde uygulanan biyosistemler tarafından tanıtıldı. Sözde gerçek zamanlı qPCR, floresan sinyalini sürekli olarak izlemek için floresan gruplarının PCR reaksiyonuna eklenmesini ifade eder. Görünüm sırası ve sinyal gücünün değişimi, hedef genin ilk miktarını gerçek zamanlı olarak analiz etmek için kullanılabilir. Bu teknolojinin icadı, niteliksel olarak nicel pcr'ye sıçramayı gerçekleştirir.
2. PCR floresansında kullanılan kimyasallar
Şu anda, gerçek zamanlı qPCR iki kategoriye ayrılır: kullanılan farklı floresan kimyasallara göre floresan boyaları ve floresan probları.
3. PCR floresansında kullanılan boyalar
Floresan boyalara da DNA bağlama boyaları denir. Şu anda kullanılan ana boya molekülü SYBR yeşil I. SYBR Green, özellikle çift sarmallı dna'nın küçük oluğuna bağlanabilirim. Serbest SYBR yeşil neredeyse hiç floresan sinyali yok, ancak çift telli dna'ya bağlanır. Bundan sonra floresan sinyali yüzlerce kez artırılabilir. PCR ürününün artmasıyla, PCR ürününün ve boyasının bağlanma miktarı da artar ve floresan sinyalinin yoğunluğu çift telli DNA moleküllerinin sayısını temsil eder.
Floresan boyaların avantajları, kullanımı kolay, herhangi bir PCR ürünüyle birleştirilebilir ve ucuzdur.
Genel olarak, SYBR Green I yöntemi en temel ve yaygın olarak kullanılan gerçek zamanlı qPCR deneylerinden biridir.
4. PCR floresan için problar
Gerçek zamanlı qpcr'deki en yaygın kullanılan floresan probları TaqMan problarıdır. Temel prensip, hedef gene özel olarak hibridize edebilen bir prob tasarlamak ve sentezlemektir. Probun 5 'ucu fluorophore ile etiketlenmiştir ve 3 'ucu bir söndürücü grubu ile etiketlenmiştir.
Normal şartlar altında, iki grup arasındaki uzamsal mesafe çok yakındır ve floresan geni su verme nedeniyle floresan olamaz. PCR amplifikasyon sırasında, astar ve prob şablona aynı anda bağlanır ve probun bağlanma pozisyonu, akış yukarı ve aşağı akış primerleri arasında bulunur.
Amplifikasyon, probun bağlandığı konuma uzandığında, Taq enzimi, probun 5 'ucuna bağlı floresan molekülünü cleave etmek için 5 'exonuclease aktivitesini kullanır. Floresan olmasına neden oluyor. Tespit edilen floresan moleküllerinin sayısı, PCR ürünlerinin sayısıyla orantılıdır, bu nedenle, PCR reaksiyon sistemindeki floresan yoğunluğuna göre ilk DNA şablonları sayısı hesaplanabilir.
TaqMan prob teknolojisi, floresan boyaların ve spesifik olmayan amplifikasyonun kombinasyonunun problemini çözer. Reaksiyondan sonra, test süresini kısaltan erime eğrisi algılamaya gerek yoktur.
TaqMan prob teknolojisinin avantajları düşük floresan arka plan, yüksek hassasiyet, yüksek hibridizasyon kararlılığı, iyi floresan spektral çözünürlük ve yüksek özgüllüktür.
TaqMan problarının yüksek özgüllüğü nedeniyle, özellikle insan gen polimorfizmleri için alelik ayrımcılık için ve snp'ye dayalı suşları ayırt etmek ve ölçmek için kullanılabilir.
Bize e-posta: